Bownds e colaboradores (1996) realizaram um dos estudos
pioneiros sobre o uso da citometria de fluxo em testes de
susceptibilidade a antimicrobianos. Tais pesquisadores
usaram a cepa Mycobacterium fortuitum ATCC 14467 e o
corante diacetato de fluoresceína (FDA) nos ensaios com
antimicrobianos para determinar a concentração mínima
inibitória. Na primeira parte do ensaio, os autores avaliaram o
padrão de interação do corante com a cepa micobacteriana
(viável ou inativada pelo calor) e com o meio de cultura, o
qual poderia levar à interpretação errônea dos resultados
quanto à fluorescência. Após a incubação, um volume de
10ml de FDA (10 mg/ml; Sigma) foi adicionado às soluções
de meio de cultura com células cultivadas por sete dias a
37°C de M. fortuitum ou ao controle negativo de forma a obter
uma concentração final de 100 ng/ml. As suspensões foram incubadas a 37°C por 30 min e
analisadas a 488nm com FACScam flow cytometer (Becton
Dickinson Immunocytometry Systems) utilizando FAC Scan
Lysys II software para a acquisição de dados e análise. Os
gráficos resultantes estão na figura abaixo. Legenda da Figura: Os números nos eixos y e x de cada
painel são 100
, 101
, 102
, 103
e 104
, respectivamente.
Usando seus conhecimentos de citometria de fluxo e
micobacteriologia laboratorial, assinale a alternativa correta.

Question

Bownds e colaboradores (1996) realizaram um dos estudos
pioneiros sobre o uso da citometria de fluxo em testes de
susceptibilidade a antimicrobianos. Tais pesquisadores
usaram a cepa Mycobacterium fortuitum ATCC 14467 e o
corante diacetato de fluoresceína (FDA) nos ensaios com
antimicrobianos para determinar a concentração mínima
inibitória. Na primeira parte do ensaio, os autores avaliaram o
padrão de interação do corante com a cepa micobacteriana
(viável ou inativada pelo calor) e com o meio de cultura, o
qual poderia levar à interpretação errônea dos resultados
quanto à fluorescência. Após a incubação, um volume de
10ml de FDA (10 mg/ml; Sigma) foi adicionado às soluções
de meio de cultura com células cultivadas por sete dias a
37°C de M. fortuitum ou ao controle negativo de forma a obter
uma concentração final de 100 ng/ml. As suspensões foram incubadas a 37°C por 30 min e
analisadas a 488nm com FACScam flow cytometer (Becton
Dickinson Immunocytometry Systems) utilizando FAC Scan
Lysys II software para a acquisição de dados e análise. Os
gráficos resultantes estão na figura abaixo. Legenda da Figura: Os números nos eixos y e x de cada
painel são 100
, 101
, 102
, 103
 e 104
, respectivamente.
Usando seus conhecimentos de citometria de fluxo e
micobacteriologia laboratorial, assinale a alternativa correta.  Alternativa A: O Quadro C é referente ao crescimento de
Mycobacterium fortuitum na presença de FDA e na
ausência do meio de cultura 7H9. Ou Alternativa B: O Quadro B é referente ao crescimento de M. fortuitum
em meio de cultura 7H9 na ausência de FDA. Ou Alternativa C: O Quadro A é referente ao meio de cultura 7H9 contendo
FDA na presença de células de M. fortuitum mortas por
calor Ou Alternativa D: O Quadro D é referente ao controle negativo do
experimento, contendo meio de cultura 7H9 sem a adição
de FDA ou M. fortuitum. Ou Alternativa E: Os Quadro C e D consistem em células de M. fortuitum,
cultivadas em 7H9 na ausência de FDA, e em células de
M. fortuitum, cultivadas mortas pelo calor na presença de
FDA, respectivamente.

Drauzio Jr · Accepted Answer

Alternativa [B] O Quadro B é referente ao crescimento de M. fortuitum
em meio de cultura 7H9 na ausência de FDA. A alternativa correta é a B, que se refere ao crescimento de M. fortuitum em meio de cultura 7H9 na ausência de FDA. Isso é indicado pela ausência de fluorescência nos gráficos. Na figura apresentada, cada painel corresponde a uma condição experimental diferente, combinando a presença ou ausência de FDA e a viabilidade da célula. No quadro B, observa-se um padrão de fluorescência baixo e homogêneo, indicando ausência de interação com o corante FDA, o que indica que a cepa de M. fortuitum está crescendo no meio de cultura sem a adição do corante. A utilização da citometria de fluxo em testes de susceptibilidade a antimicrobianos pode permitir avaliar o crescimento bacteriano em condições distintas, contribuindo para um melhor entendimento de mecanismos de resistência e para o desenvolvimento de novos antibióticos.

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