Um biomédico, em seu projeto de pesquisa, obteve o clone de ...

Um biomédico, em seu projeto de pesquisa, obteve o clone de um gene de interesse. A próxima meta é entender a função do gene para o organismo. Para isso, entre as metodologias que deverão ser empregadas, haverá o sequenciamento do DNA. Assim, o biomédico decide utilizar a técnica de sequenciamento de Sanger ou sequenciamento didesóxi por ser a mais conhecida. A seguir estão descritas, de forma aleatória, as etapas do sequenciamento de Sanger.
1 Começará a síntese do filamento de DNA complementar pela polimerase, iniciando a partir do primer marcado.
2 Enfileira-se os diversos fragmentos sintetizados, todos com o mesmo ponto de início e diferentes pontos de parada, do menor para o maior, com o didesoxinucleotídeo no final de cada fragmento.
3 Desnaturam-se os dois filamentos do DNA alvo.
4 A ação da polimerase é interrompida em qualquer ponto no qual o didesoxinucleotídio trifosfato for incorporado na cadeia de DNA em crescimento, no lugar do desoxinucleotídio trifosfato normal.
5 Cria-se um primer marcado radioativamente para a síntese de DNA que hibridizará, exatamente, em um local no segmento de DNA clonado.
6 Sabendo onde é o início da síntese do DNA e qual didesoxinucleotídeo finaliza cada fragmento de diferentes comprimentos, tem-se o sequenciamento total do DNA alvo.
7 Adiciona-se um “coquetel” especial de DNA polimerase, desoxinucleotídios trifosfato normais (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), uma pequena quantidade de um didesoxinucleotídio das quatro bases (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) e os primers.
Para realizar a técnica de sequenciamento corretamente, o biomédico deverá seguir a seguinte ordem de etapas: