De acordo com protocolos rotineiramente empregados na diagno...

MgCl₂ doa íons Mg²⁺, cofatores indispensáveis para a atividade da enzima Taq polimerase empregada na amplificação de DNA viral. Na ausência de MgCl₂, há insucesso na amplificação.

Primers são iniciadores que definem o limite da amplificação genômica. Possuem de 15 a 25 bases complementares às fitas alvo. Quanto maior o número de nucleotídeos, mais específicos e maiores os fragmentos amplificados.

A enzima DNA polimerase catalisa a extensão dos primers. Quando em excesso na reação pode provocar o surgimento de bandas inespecíficas, o que pode ser corrigido apenas reduzindo a temperatura de anelamento do programa utilizado.

Programa de PCR ideal para amplificação de ácidos nucleicos: 96°C por 5 min (desnaturação padrão); 75°C por 2 min (anelamento); 62°C por 2 min (extensão), 38 ciclos; extensão final 62°C por 10 min. Manter temperatura do programa final a 4°C.

São componentes de uma reação de PCR para amplificação de fragmento de DNA: Tampão da enzima contendo Na⁺ , Cl^– , K⁺ ; dNTP’s; primer forward; primer reverse DNA molde; transcriptase reversa; Taq polimerase; água ultrapura. Uso de luvas é obrigatório.